Nobelpriset i Stockholm och den skoningslösa elektronstrålen - Så långt kom vi i Vasastan och i Solna

Vi var lyckliga då vi såg på den fluoriscernande skärmen i elektronmikroskopet (övre bilden), våra snitt som låg nedfrusna på ett preparatnät, en grid. När vi ökade förstoringsgraden såg vi bara svart (nedre bilden). I svärtan, i det snabbt nedfrusna vattnet låg gömda våra vävnader. Ingen kontrast!

Vi var ett team, Tudor Barnard, Godfried Roomans, Lahja Svéus och jag. Vi hade (nästan) all utrustning och tack vare Lahja kunde vi få de bästa tänkbara snitt (bästa i världen) av den frusna vävnaden. Egentligen så hade vi helt olika projekt men en gemensam apparatur och ett gemensammt intresse för den tekniska utvecklingen.

Tudor som har varit först i kontakt med Jacques Dubochet, som tilldelats Nobelpriset i kemi 2017. Dubochet konstruerade en maskin för att kunna snabbt frysa biologiska prover och "killarna på verkstad" vid Wennergrens Institut i Stockholm byggde senare en likadan. 

Vi träffade senare Jacques Dubochet, och Richard Henderson i Cambridge. Jacques Dubochet var precis färdig med sin doktorsexamen medan jag fortfarande höll på min.

Tudor var mer intresserad av makromolekyler medan Godfried och jag ville visualisera vävnaderna. Lahja var intresserad att sälja maskiner som snittade prover vid mycket låga temperaturer där provet fanns i en kammare som fylldes med flytande kväve. Ingen av oss var intresserad av virus som ur prepareringssynpunkt var det enklaste att studera då man slapp att snitta provet samt att vatten bundet till ett virus är försumbar jämfört med muskel- eller levervävnad.

Så Lahja producerade snitten och vi flyttade de till elektronmikroskopet fortfarande djup nedfrusna och tittade på de i nedfruset skick i elektronmikroskopet.

Vi var lyckliga då vi såg våra snitt som låg nedfrusna på ett preparatnät av metall, en grid. När vi ökade förstoringsgraden såg vi dock bara svart. I svärtan låg gömda våra vävnader i det snabbt nedfrusna vattnet. Ingen kontrast! Inga strukturer!

Det stora problemet var den skoningslösa elektronstrålen. Om man hade lite strö så såg man inget eller en vävnad inbäddad i vitriferat vatten - inget som gav kontrast. Om man ökade något på elektronstrålens styrka så kokade vatten i provet och en minikrater bildades. I de mjuka biologiska vävnaderna är vattenandelen 70-80% så vi förstod från början att kontrasten mot proteiner skulle bli oerhört låg. Att ta bilder av de svarta snitten och försöka klämma ur de mha de fotografiska motoderna gav inget. Vi behövde en digitalkamera och datorer. Troligen behövdes vid den tiden en datorstyrka från alla datorer vid KTH, SU och KI för att kunna bearbeta bilderna av prover i vitriferad tillstånd. Vi kunde dock få fram den kemiska sammansättningen från provet då vi hade en mikroanalysutrustning kopplad till elektronmikroskopet.

Om man tillät snittet att långsamt frystorka, att vatten skulle försvinna så kom fram alla vävnadsstrukturer.

Det var en kompromiss att låta frystorka proverna, "en uppvärmning" till minus 100C, annars såg vi nästan ingenting. Vi försökte ta bilder av svärtan och försöka att framkalla de med olika filmframkallare och olika fotografiska papper men det svarta som vi såg i mikroskopet förblev svart. Vi hade inga datorer på den tiden (utom en ordbehandlare) och senare när vi fick de första så förstod vi samtidigt att även med de kraftigaste datorer som fanns tillgängliga i Sverige så skulle vi inte åstadkomma en bild av cellens inre såsom vi ville.

Genom mina forskarkontakter i Schweiz fick jag tag i en plast som kunde härda vid minus grader. Jag började arbeta hur vore det med att byta ut vattnet i provet mot den lågviskösa plasten. Allt vid mycket låga temperaturer. I Schweiz försökte man med att byta ut vattnet mot nedkylda lösningsmedel och alkohol. Jag valde en annan väg, en kontrollerad frystorkning. 
Jag byggde med folk från Karolinskas MTA stora maskiner där frusna prover frystorkades i högvakuum och därefter, fortsättningsvis i vakuum impregnerades prover med plaster som fick senare ett namn Lowicryl. Lowicryl var plasten som härdade, polymeriserades vid minustemperaturer.
  

Jag, då en doktorand och mina föräldrar och moster vid trappan av Wenner-Grens Institutet (trol. 1976).

Wnner-Grens Institut i Stockholm. På höger sida av bilden syns ett antal svarta fönster. Här stod våra kryoelektronmikroskop. Huset finns inte mera. Verkstaden som tillverkade våra kryoprylar finns kvar och fungerar som dagis

En skiss avv LTVEP-processor. LTVEP stod för Low Temperature Cacuum Embedding Processor. Bilden är från en artikel från Journal of Microscopy där även Nobelpristagarna 2017 - Jacques Dubochet och Richard Henderson publicerade samtidigt sina fynd.

Mitt laboratorium vid Patologiska Institutionen, Karolinska Institutet. Jag byggde med folk från Karolinskas MTA stora maskiner där frusna prover frystorkades i högvakuum och därefter, fortsättningsvis i vakuum impregnerades prover med plaster som fick senare ett namn Lowicryl. På bilden LTVEP-processor. LTVEP stod för Low Temperature Cacuum Embedding Processor.

Den stora fördelen med den metoden var att man kunde förutom strukturen i cellerna studera deras kemiska sammansättnig eller göra de histokemiska färgningarna för att påvisa olika enzymer eller substrat.

Bilden är från min artikel från Journal of Microscopy där även Nobelpristagarna 2017 - Jacques Dubochet och Richard Henderson publicerade samtidigt sina fynd.

Bilden är från min artikel från Journal of Microscopy där även Nobelpristagarna 2017 - Jacques Dubochet och Richard Henderson publicerade samtidigt sina fynd.